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        4.  
          標題摘要內容
           circRNA服務

          circRNA服務?
          circRNA AAV與慢病毒包裝服務
          來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2018-03-29 | 7621 次瀏覽 | 分享到:
          1. circRNA AAV包裝服務
          1.1 腺相關病毒(AAV)簡介

          腺相關病毒(Adeno-Associated Viral Vector,AAV)是一類微小的單鏈DNA病毒,直徑約20-30nm,它依賴于其他病毒(如腺病毒)進行復制。AAV基因組約4700bp,包括上下游兩個開放讀碼框架(ORF),位于分別由145bp組成的2個反向末端重復序列(ITR)之間。重組腺相關病毒(Recombinant AAV,rAAV)去除了其基因組的全部編碼蛋白序列Rep和Cap,只留兩端帶有ITR序列作為包裝信號。1984年始rAAV載體被證明能轉導外源基因進入哺乳動物細胞內,1990年被FDA認可,成為用于臨床的安全基因傳遞載體?,F在AAV因具有宿主范圍廣、安全性高、免疫原性低、表達穩定和物理性質穩定等優點,已被廣泛地應用于基礎研究和臨床試驗。

          至今,已出上百種自然界AAV血清型和經工程改造外殼的 AAV 載體。這些載體具有不同的器官、組織特異性及其它獨特的性質,讓基因轉導工具的選擇更豐富更個性化。
           
           圖1 AAV基因組結構
          1.2 腺相關病毒(AAV)生物學特性:
          表1 不同病毒的生物學特性比較
          AAV病毒特點:
          1 安全性高:野生型AAV暫未發現對人體致病,重組AAV去除了大部分基因組元件,更為安全;
          2 免疫原性低:AAV的基因組僅4700bp,進行動物實驗時造成的免疫反應??;
          3 宿主范圍廣:能感染分裂細胞和非分裂細胞,可用于細胞水平和動物水平;
          4 表達穩定:能介導基因在一定時期內的穩定表達;
          5 病毒穩定:在-80℃可長期保存。
          1.3 腺相關病毒(AAV)載體不同血清型:

          研究發現AAV具有多種血清型,各種不同血清型的AAV載體的主要區別是衣殼蛋白不同,因此對不同的組織和細胞的轉染效率存在差異。由于相同的 AAV 血清型在嚙齒類動物及靈長類動物中的感染特性不盡相同,在文獻中對各組織的 AAV 血清型感染能力比較可能存在不同結果,可以參考前人的研究結果,針對不同組織器官選擇相應血清型的AAV病毒,或通過預實驗測試確定理想的血清型。

           表2 動物體內實驗血清型推薦(小鼠)


          1.4 circRNA過表達腺相關病毒(AAV)結果展示
           
           CNE2細胞(AAV感染48h)                  小鼠結腸組織(AAV感染3周)

          小鼠尾靜脈注射AAV 三周后提取組織RNA進行熒光定量PCR檢測;與注射空白對照病毒組相比,注射Has_circ_0000147 過表達病毒組的小鼠,在心肌組織和肝臟組織中Has_circ_0000147表達量明顯上調,分別是對照組的69倍和142倍。

             

          293細胞感染不同circRNA過表達AAV 48h后提取RNA進行熒光定量PCR檢測,與感染對照病毒組相比,過表達AAV組上調幾百至幾千倍。

            
          1.5 腺相關病毒(AAV)服務內容



          2. circRNA 慢病毒包裝服務

          2.1 慢病毒簡介

          慢病毒(Lentivirus)是逆轉錄病毒的一種。以慢病毒基因組為基礎,由所需的目的基因取代部分基因構建而成現在常用的慢病毒載體,已成為生物科研工作中重要的研究工具。慢病毒載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而實現持久表達。在感染能力方面,我們提供的慢病毒其外殼蛋白為 VSVG,可以有效感染分裂和非分裂細胞,應用十分廣泛?,F使用的慢病毒為“自殺”性病毒,即病毒感染目的細胞后不會再感染其他細胞,也不會利用宿主細胞產生新的病毒顆粒,使用更加安全。不過,雖然慢病毒中的毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代,屬于假型病毒,但該病毒仍然具有潛在的生物學危險,建議不要使用編碼已知可能會致癌或有毒性的基因的假型病毒。我公司推出的circRNA 過表達載體pLO5-ciR、pLC5-ciR均為慢病毒載體,可用于瞬時轉染或慢病毒包裝。  


          2.2 慢病毒生物學特性:
          1 安全性高:慢病毒中的毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代,屬于假型病毒;
          2 宿主范圍廣:能感染分裂細胞和非分裂細胞,可用于細胞水平和動物水平;
          3 表達穩定:高頻整合,通過篩選可以獲得穩定表達細胞株;
          4 插入基因長度大:一般線性序列6k以內可以構建載體,circRNA因環化效率限制,一般建議200-2000bp。


          2.3 circRNA過表達慢病毒結果展示

           

           293細胞(慢病毒感染48h)             U87細胞(慢病毒感染48h)




          293細胞感染circRNA過表達慢病毒48h后篩選,獲得穩定細胞株后提取RNA,進行PCR檢測。與感染對照病毒組相比,過表達慢病毒組明顯上調。

                      

          2.4 慢病毒服務內容

          在火车上和陌生朋友发生性关系