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          circTLK1加重缺血性中風引起的神經元損傷
          來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2019-07-25 | 118 次瀏覽 | 分享到:


          最近發表在JOURNAL OF NEUROSCIENCE期刊(IF=6.074)上的一篇circRNA與腦缺血后再灌注損傷有關的研究論文,報道了circTLK1表達在小鼠腦局部缺血和再灌注后明顯上調,其通過海綿miR-335-3p并抑制miR-335-3p活性,繼而上調TIPARP基因表達,增加梗死面積,加重神經元損傷和神經功能缺陷的癥狀。通訊作者是來自東南大學醫學院藥理學系的姚紅紅教授。姚紅紅教授是今年第五屆circRNA研究論壇的特邀嘉賓,一直關注和從事circRNA與神經炎性相關神經系統疾病的關系研究,歡迎大家踴躍參加。


          敲低circTLK1表達減少缺血后腦梗死面積

          作者通過在建立短暫的大腦中動脈閉塞小鼠模型tMCAO后,對比假手術組和缺血梗死組的組織中circRNA表達譜差異,篩選出缺血梗死組組織中表達上調水平較高的circTLK1。RT-qPCR驗證發現circTLK1在小鼠眾多器官中表達,尤其在腦、脾和肺的表達水平較高。同時在小鼠血漿和梗死同側皮質中發現表達上調的circTLK1,而TLK1 mRNA和蛋白水平卻出現下降。為了研究circTLK1在缺血性中風疾病過程起什么作用,作者構建circTLK1 shRNA慢病毒載體注射到小鼠側腦室,IF驗證病毒轉染神經元成功,RT-qPCR驗證體內敲低效果明顯,3周后在小鼠身上建立tMCAO缺血再灌注模型,結果顯示敲低circTLK1表達雖然不影響到腦血流量和缺血面積,但是會明顯減輕神經功能缺陷癥狀(表現為神經系統缺陷評分降低),減少缺血再灌注后腦梗死體積。





          敲低circTLK1表達減輕缺血后神經功能缺陷的癥狀

          為了詳細評估circTLK1對于小鼠中風后神經功能缺陷的影響,作者采用三個實驗(神經系統缺陷評分、粘合劑去除試驗和圓筒試驗)進行評估tMCAO后第0, 3天和7天小鼠的早期癥狀。體內敲低circTLK1表達可明顯減輕tMCAO后神經功能缺陷的癥狀(神經系統缺陷評分降低)和改善軀體感覺功能(粘合劑去除試驗和圓筒試驗)。而且敲低circTLK1表達可以明顯減輕由tMCAO導致凋亡相關蛋白Bax/Bcl-xlcaspase-3/pro caspase-3比例上調的情況。


                 
          接著在評估
          tMCAO后第0, 14, 2128天小鼠的晚期癥狀,發現敲低circTLK1表達依然可以改善tMCAO后神經功能缺陷的癥狀和改善軀體感覺功能,同時還可以減輕第28天腦萎縮的情況,增加梗死周邊皮質的樹突復雜性和樹突棘的數目,rescue原本由tMCAO導致突觸蛋白synapsin-1PSD95蛋白水平下調的情況。



          敲低
          circTLK1表達減輕腦中風導致的神經元損傷

          在腦部眾多細胞中,原代皮質神經元細胞中circTLK1的表達水平較高。神經元細胞經缺氧無糖后再灌注(OGD/R)處理模擬體內缺血再灌注后,circTLK1的表達水平明顯上調,而TLK1 mRNA表達水平則下調。體外轉染circTLK1 shRNA慢病毒可明顯并特異地敲低circTLK1的表達,但不影響TLK1 mRNA表達。OGD/R處理可促進神經元細胞死亡,而同時敲低circTLK1表達則促進其存活。WB實驗也證明了敲低circTLK1表達可明顯降低Bax/Bcl-xlcaspase-3/pro caspase-3比例。



          為了評估敲低
          circTLK1表達對于突觸蛋白synapsin-1PSD95的影響,轉染circTLK1 shRNA可以明顯上調OGD/R處理后神經元細胞中synapsin-1PSD95蛋白水平,維持神經元marker-- MAP-2水平和神經元突起的長度,保持軸突的長度和樹突棘的數目,這些提示敲低circTLK1的表達對于神經元功能的維持和保護有重要的意義。



          在神經元中特異性敲低
          circTLK1可有效保護神經元

          作者構建含circTLK1 shRNA序列的腺病毒,注射到小鼠側腦室,特異性敲低神經元circTLK1的表達,用于動態觀察circTLK1在腦中風發生過程中的作用。特異性敲低神經元circTLK1的表達,雖然不影響到腦血流量和缺血面積,但是會明顯減輕tMCAO后第3, 7天的神經功能缺陷癥狀和改善軀體感覺功能。


          通過觀察tMCAO后第14, 2128天小鼠晚期癥狀,發現敲低神經元circTLK1的表達可明顯減輕腦萎縮的癥狀,還可以改善神經功能缺陷癥狀和軀體感覺功能,進一步提示敲低神經元circTLK1的表達對于中風早期和晚期的重要保護意義。


          敲低
          circTLK1表達保護神經元的機制是什么?

          通過對比tMCAO組和假手術組的小鼠腦組織mRNA表達譜,發現腦梗死區域和周邊區域的TIPARP mRNA水平明顯下調。已有研究報道過,TIPARP參與缺血性腦損傷的發生過程。下一步作者通過數據庫尋求靶向TIPARPcircTLK1miRNAs,只有miR-335-3p, miR-320-3p miR-129-5p這三個候選分子。而經tMCAO6h后缺血皮質中miR-335-3p的表達水平是明顯下調的。miR-335-3pcircTLK1是否存在結合作用呢?RNA-pull down證明miR-335-3p可以富集并結合circTLK1;而反向親和分離實驗證明circTLK1也可捕獲并富集miR-335-3p。FISH實驗證明miR-335-3pcircTLK1共定位于原代皮質神經元的胞漿中。



          另一方面,
          miR-335-3pTIPARP是否存在結合作用呢?經數據庫預測TIPARP mRNA 3’-UTR區域包含miR-335-3p結合位點。同時luciferase報告基因實驗證明miR-335-3pTIPARP 3’-UTR存在相互結合作用。體內實驗發現經tMCAO處理12h 至第7天,缺血組織中TIPARP水平明顯上調。經OGD/R處理后 ,皮質原代神經元中TIPARP表達水平也明顯上調。另外,無論是否給予OGD/R處理,同時過表達miR-335-3p時,神經元中TIPARP表達水平則明顯下調;當抑制miR-335-3p表達時,則出現相反的結果。這些結果提示circTLK1/miR-335-3p/TIPARP調控軸的存在。



          circTLK1/miR-335-3p/TIPARP
          對于神經元損傷的意義

          OGD/R處理可以促進神經元的死亡,同時過表達miR-335-3p則會維持神經元的存活,這可能與上調突觸相關蛋白synapsin-1 PSD95表達有關 ;而同時抑miR-335-3p表達則無法維持其存活,這可能與synapsin-1 PSD95表達下調有關。敲低circTLK1表達可明顯抑制由OGD/R處理引起上調的TIPARP蛋白水平。敲低circTLK1表達可下調TIPARP蛋白水平,維持神經元存活的效應,會被anti-miR-335-3p處理所逆轉,進一步說明circTLK1通過miR-335-3p調控TIPARP的表達。另外,敲低TIPARP表達會明顯維持經OGD/R處理的神經元存活。體內實驗也證明,tMCAO小鼠在敲低circTLK1表達后,腦組織中的TIPARP的表達也出現明顯下調。

           
          敲低
          miR-335-3p表達下調PSD95蛋白水平和降低樹突棘密度的效應,會被敲低circTLK1表達所逆轉。另外敲低TIPARP表達可逆轉OGD/R處理所誘導PSD95蛋白下調的效應。體外OGD/R模型的基礎上利用rescue實驗驗證circTLK1/miR-335-3p/TIPARP軸的相互調控關系。



          在神經元中特異性敲低
          TIPARP表達可有效改善神經系統缺陷

          構建含TIPARP shRNA序列的腺病毒注射入小鼠側腦室28天后,在神經元中TIPARP表達可被特異性敲低。接著誘導tMCAO后,發現腦血流量和缺血面積不受影響,但是腦梗死體積明顯減少,神經系統缺陷評分和軀體感覺功能得到明顯改善。


          經過長期觀察(
          tMCAO后第28天),TIPARP敲低組小鼠腦萎縮的情況得到明顯的改善,神經系統評分和軀體感覺功能也得到明顯改善。原本在tMCAO后突觸相關蛋白synapsin-1 PSD95表達下調的情況,在同時敲低TIPARP表達后,這兩種蛋白出現明顯上調。



          CircTLK1
          的臨床意義是什么?

          相比于健康人群,患有急性缺血性中風AIS的病人血漿中circTLK1表達水平出現明顯上調。AIS疾病分為大動脈粥樣硬化LA, 小動脈阻塞SA, 和心源性栓塞CE三種亞型,而只有LASA亞型患者血漿中circTLK1表達水平出現明顯上調。通過對比發生中風的不同部位,發現只有患有皮質和皮質下梗死的患者血漿中circTLK1表達水平出現明顯上調。ROC曲線分析顯示circTLK1可能作為臨床診斷AIS和提示AIS嚴重程度的重要標志物,而且AIS患者發生梗死面積越大,其circTLK1表達水平越高。


          總結:作者通過對比正常腦組織,從tMCAO小鼠腦組織circRNA表達譜中篩選到表達上調程度相對高的circTLK1,首先從宏觀表型分析,敲低circTLK1減少腦梗死面積,改善神經系統功能缺陷和減輕神經元損傷;接著微觀機制研究,從tMCAO小鼠腦組織中篩選到已有研究報道過的TIPARP基因,再經生信分析預測并驗證TIPARPcircTLK1兩者之間的介導者—miR-335-3p。然后通過體外OGD/R證實circTLK1/miR-335-3p/TIPARP軸的相互調控對于保護神經元、改善神經系統功能缺陷的重要意義。最后回歸臨床,數據統計分析circTLK1有可能作為提示AIS嚴重程度的重要指標。總的來說,靶向敲低circTLK1TIPARP表達、過表達miR-335-3p有助于改善AIS引起的神經系統缺陷癥狀和保護神經元不受損傷。這是少有的circRNA在神經系統疾病方面的研究,如果課題研究有關神經系統疾病方面,可借鑒本文的研究方法。


          參考文獻:

          1. Wu F , Han B , Wu S, et al. Circular RNA TLK1 aggravates neuronal injury and neurological deficits after ischemic stroke via miR-335-3p/TIPARP. J Neurosci. 2019 Jul 16. pii: 0299-19. doi: 10.1523/JNEUROSCI.0299-19.2019.(解讀用圖均來自此文獻)

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